Dafné Wilhelm, étudiante en thèse dans les équipes 4 (IDePRAP) et 2 (MolCellTeg) du laboratoire IMoPA soutiendra publiquement sa thèse le 04/12/2019 à 14h00, amphi 8 à la Faculté des Sciences et Technologies de l'Université de Lorraine.

Son travail de thèse a largement reposé sur l’utilisation de méthodes d’analyse quantitative relative des protéines et le développement de méthodes d’extraction et de préparations d’échantillons dédiées à la matrice extracellulaire, en collaboration avec la plateforme de protéomique, pour caractériser les évènements de maturation des procollagènes, notamment dans le modèle cellulaire de chondrogénèse ATDC5. Un travail qui ne pouvait être abordé sans l’utilisation de la spectrométrie de masse, tant pour la caractérisation des modifications post-traductionnelles que pour les aspects quantitatifs.

La présentation publique de ses travaux est intitulée : "Utilisation du modèle cellulaire ATDC5 pour la caractérisation des mécanismes de maturation des procollagènes et de leurs relations avec le processus de minéralisation matricielle".

Ci-dessous, le résumé de ses travaux de thèse :

L'ossification endochondrale est le mécanisme par lequel les os longs se développent chez les organismes vertébrés. Elle nécessite la chondrogenèse, c'est-à-dire la différenciation contrôlée et en temps opportun des chondrocytes de la plaques de croissance, pour la formation d'un patron cartilagineux primaire, qui est ensuite remplacé par l'os. La chondrogénèse repose sur la production d'une matrice extracellulaire (MEC) dédiée qui va ensuite minéraliser et dont de nombreux aspects restent difficiles à caractériser, notamment parce que les modèles in vitro récapitulant leur complexité manquent de maniabilité. La lignée cellulaire ATDC5 maintient un état indifférencié et présente un phénotype fibroblastique tout en conservant une capacité proliférative élevée, ce qui permet une ingénierie sans restriction majeure, mais s'engage dans un programme de différenciation séquentiel ressemblant à la différenciation chondrogénique observée in vivo quand elle est stimulée par l'insuline. Cette lignée est largement utilisée depuis des décennies, mais son protéome est à peine décrit. Afin de définir dans quelle mesure le modèle récapitule les principaux aspects de la formation de la MEC du cartilage, nous avons effectué une analyse de la régulation du protéome dans le temps, axée sur la MEC des cellules ATDC5 en différenciation.

Les premières régulations protéiques survenant lors de la stimulation sont relatives au métabolisme énergétique, ce qui suggère que la différenciation ATDC5 implique une reprogrammation importante des voies métaboliques. Ensuite, les cellules ATDC5 synthétisent progressivement les composants importants pour le cartilage, qu'elles incorporent dans leur MEC, avec un certain nombre de protéines accessoires. L’agrécane notamment semble porter la plupart de ses maturations décrites dans le cartilage, ce qui suggère que l'ensemble du mécanisme de synthèse des protéoglycanes à chondroïtine sulfate est fonctionnel. De façon remarquable, le collagène cross-linké de type II est par plusieurs aspects très comparable à celui trouvé in vivo. Plus important encore, l'accumulation de collagène dans la MEC est corrélée à ses principaux événements de maturation, notamment les clivages protéolytiques et les hydroxylations de la triple hélice, plutôt qu'à l'expression des gènes et protéines du procollagène. 

En outre, les cellules ATDC5 produisent Chondrocalcine, qui correspond au C-propeptide du collagène de type II (CPII), qui est décrite comme impliquée dans le processus de minéralisation du cartilage de croissance, et l’intègre dans leur MEC. Nous avons montré par production dans le modèle ATDC5 de protéines recombinantes que CPII, contrairement à ses homologues des collagènes de type I et III (CPI et CPIII) respectivement, ne recrutait pas la même machinerie de maturation, suggérant des mécanismes de régulation du processing des collagènes différents. Prises ensemble avec des données complémentaires obtenues ex vivo et in cellulo, les données obtenues sur les ATDC5 nous ont permis de caractériser le clivage de Chondrocalcine et d’affiner, au moins partiellement, les mécanismes d’assemblage et de minéralisation de la matrice cartilagineuse. Dans l'ensemble, ces résultats mettent en évidence les cellules ATDC5 comme récapitulant une proportion considérable de la machinerie de maturation de la MEC du cartilage, qui s'avère être un déterminant majeur de sa néosynthèse. La caractérisation fonctionnelle des événements clés de l'élaboration de la MEC dans les cellules ATDC5 devrait permettre de mieux disséquer les mécanismes de la chondrogenèse et de la minéralisation.